Filho de Noêmia Monteiro Villa-Lobos e Raul Villa-Lobos, foi desde cedo incentivado aos estudos, pois sua mãe queria vê-lo médico. No entanto, Raul Villa-Lobos, pai do compositor, funcionário da Biblioteca Nacional e músico amador, deu-lhe instrução musical e adaptou uma viola para que o pequeno Heitor iniciasse seus estudos de violoncelo. Aos 12 anos, órfão de pai, Villa-Lobos passou a tocar violoncelo em teatros, cafés e bailes; paralelamente, interessou-se pela intensa musicalidade dos "chorões", representantes da melhor música popular do Rio de Janeiro, e, neste contexto, desenvolveu-se também no violão. De temperamento inquieto, empreendeu desde cedo escapadas pelo interior do Brasil, primeiras etapas de um processo de absorção de todo o universo musical brasileiro. Em 1913 Villa-Lobos casou-se com a pianista Lucília Guimarães, indo viver no Rio de Janeiro. É tio-avô de Dado Villa-Lobos.
Em 1922 Villa-Lobos participa da Semana da Arte Moderna, no Teatro Municipal de São Paulo. No ano seguinte embarca para Europa, regressando ao Brasil em 1924. Viaja novamente para a Europa em 1927, financiado pelo milionário carioca Carlos Guinle. Desta segunda viagem retorna em 1930, quando realiza turnê por sessenta e seis cidades. Realiza também nesse ano a “Cruzada do Canto Orfeônico" no Rio de Janeiro. Seu casamento com Lucília termina na década de 1930. Depois de operar-se de câncer em 1948, casa-se com Arminda Neves d'Almeida a Mindinha, uma ex-aluna, que depois de sua morte se encarrega da divulgação de uma obra monumental. O impacto internacional dessa obra fez-se sentir especialmente na França e EUA, como se verifica pelo editorial que o The New York Times dedicou-lhe no dia seguinte a sua morte. Villa-Lobos nunca teve filhos.
Faleceu em 17 de novembro de 1959. Encontra-se sepultado no Cemitério São João Batista no Rio de Janeiro.
Em 1960, o governo do Brasil criou o Museu Villa-Lobos na cidade do Rio de Janeiro.
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